慢性丙型肝炎病毒 (HCV) 感染影响超过 5000 万人，持续肝脏炎症可引发慢性肝病、纤维化甚至肝硬化。HCV复制会导致宿主内膜系统发生显著重塑。目前抗病毒药物 (DAA)已经成为主要治疗手段，但其在细胞内的作用机制尚不明确。近期，西班牙CSIC生物技术中心与ALBA 同步加速器光源实验室的研究团队，借助低温软X射线断层扫描（CLSXT）技术、软X射线细胞结构显微镜SXT-100及透射电子显微镜（TEM）等多模态成像技术，成功探究了宿主细胞在持续复制 HCV 时对 DAA 治疗的早期反应，相关研究成果为理解 HCV 感染的细胞病理学和抗病毒治疗机制提供了全新视角。
软X射线细胞结构显微镜SXT-100
多技术联用解析病毒清除过程展开剩余87%研究采用HCV亚基因组复制子（HCV-SGR）细胞模型，结合多种前沿技术开展实验：
共聚焦免疫荧光：用于观察病毒蛋白和细胞器的分布情况，为后续研究提供基础定位信息。 透射电子显微镜（TEM）：用于观察细胞的超微结构变化，捕捉病毒复制相关的细微结构特征。 冷冻光软X射线断层扫描（CLSXT）：如下图所示，通过 SXT-100 实现细胞三维地图绘制，将荧光信号与 X 射线断层扫描图像对比分析，精准识别病毒和细胞器结构，清晰揭示 DAA 处理后病毒蛋白的分布变化，助力观察病毒诱导的膜结构变化。 Western Blot和实时定量PCR（RT-qPCR）：用于检测病毒蛋白和RNA，从分子层面量化 DAA 治疗效果。DAA 治疗快速启动病毒清除机制1. 病毒蛋白和RNA的快速清除：如下图所示，DAA处理后，HCV蛋白NS3在24小时和48小时后分别减少了3倍和5倍；病毒RNA在24小时和48小时后分别减少了30倍和200倍。
2. 细胞应激标志物的恢复：DAA治疗后48小时，细胞应激标志物ATF3 mRNA水平恢复正常，表明病毒诱导的应激得到缓解。
3. 细胞器的变化：如下图所示：免疫荧光共聚焦显微镜观察HCV-SGR细胞在DAA处理后不同时间点的高尔基体形态。结果显示，未处理的HCV-SGR细胞中，高尔基体呈现分散状态，而DAA处理后72小时和96小时，高尔基体恢复为紧凑的形态。
内质网（ER）：HCV感染导致ER重塑金斧子配资，形成膜网。DAA治疗后，这种膜网结构在24小时内几乎完全消失。内溶酶体/多泡体（EL/MVB）：DAA治疗后，EL/MVB结构显著增加，尤其是在24小时后，这些结构可能参与病毒机制的清除。
4. 病毒机制的清除与内溶酶体系统的关联：如下图所示：通过CLSXT和TEM观察到，DAA治疗后，病毒蛋白NS5A残余物与内溶酶体标记物共定位，表明内溶酶体系统可能在病毒机制的清除中起重要作用。
DAA治疗能够快速且有效地清除HCV复制机制，大部分病毒蛋白和RNA在治疗后的前48小时内被清除。病毒机制的清除与内溶酶体系统的激活密切相关，内溶酶体/多泡体结构在病毒清除过程中起到关键作用。干扰溶酶体功能或自噬过程并未影响DAA治疗的疗效，表明病毒机制的清除可能通过其他途径实现。
研究意义本研究通过多模态成像技术揭示了DAA治疗后HCV复制机制的清除过程，为理解HCV感染的细胞病理学和抗病毒治疗的机制提供了新的视角。这些发现有助于进一步优化抗HCV治疗策略，并为开发新的抗病毒药物提供理论依据。同时，该研究创新性将cryo-SXT、TEM及共聚焦显微镜等多模态成像技术整合，提供从纳米到微米尺度的动态视图。
SXT-100突破传统成像局限，赋能精准研究传统透射电子显微镜对细胞内病毒成像存在诸多局限，如化学固定、切片等操作易产生切片伪影，无法观测直径＞300 nm 的大尺度病毒结构，单一切片仅能提供二维局部视图导致三维信息缺失，且分子定位能力不足难以关联活细胞标记等。而软 X 射线细胞结构显微镜 SXT-100 凭借特有技术优势，成为本研究的核心工具：
三维近天然状态成像：对完整冷冻细胞进行高分辨率（约35 nm）三维成像，避免化学固定或切片导致的伪影。 动态追踪膜结构变化：可视化HCV诱导的膜结构网络（如内质网衍生的管状囊泡）及其清除动态，为研究病毒复制与清除过程中的膜结构重塑提供直观依据。 关联冷冻荧光定位（CLSXT）：结合荧光标记（如NS5A-mCherry、线粒体绿色探针MTG），在X射线断层图中精准定位病毒蛋白和细胞器（图4-5）。发现DAA治疗后24小时，NS5A残余集中于高吸收对比度的多形性结构（内溶酶体）。 区分病毒结构特征：识别直径>300nm的HCV复制相关囊泡（非DMVs），可能为扩大的内质网或多膜囊泡 定量三维分析：通过体积渲染（Amira软件）精确计算细胞器空间占比。SXT100引领细胞成像新方向软X射线细胞结构显微镜SXT100是前沿的软X射线成像设备之一，能够提供高达50 nm分辨率的三维细胞成像。该仪器采用创新的X射线源和探测器技术，能够在短时间内获取大量的高质量图像数据，为研究人员提供强大的工具来探索细胞内部的复杂结构和功能。
技术特点：
高分辨三维成像：分辨率达50 nm。 含水细胞兼容性：基于“水窗”能量（280-530 eV）的软X射线吸收特性，SXT-100可直接对全水合、冷冻样本成像，避免化学固定或染色对结构的干扰。 多模态联用：SXT-100集成荧光显微镜功能，通过荧光信号定位目标区域（如纳米颗粒、细胞器），再利用SXT获取三维结构信息。 厚样品穿透能力：可成像10-20 μm厚度的完整真核细胞（如藻类），克服光学显微镜局限。 无需冷冻/切片：避免电镜制样假象，保留原生状态。软X射线细胞结构显微镜 SXT-100
SXT-100的应用案例 酵母细胞脂噬过程研究如下图所示，SXT成像对冷冻酵母细胞（Saccharomyces cerevisiae）进行3D成像，可以非常直观地展示脂滴（黄色）与消化液泡（棕色）的空间分布动态，揭示饥饿诱导的脂噬（lipophagy）机制。
纳米药物递送在细胞内3D成像如下图所示，在HeLa细胞（HeLa）中，SXT-100成功追踪100 nm荧光聚苯乙烯纳米颗粒（NPs）的溶酶体共定位，可以提供荧光信息与纳米药物递送载体在细胞内的3D共定位信息，为优化药物载体设计提供结构依据。
复杂真核生物成像如下图所示，SXT-100可以对眼虫（Euglena gracilis）的进行纳米级3D无标记成像，结合荧光标记叶绿素进行三维结构表征，可以清晰呈现鞭毛、类核体及光合膜系统等复杂真核生物内的细胞器结构，为单细胞生物功能研究提供新视角。
关于 SiriusXT LtdSiriusXT Ltd是成立于爱尔兰的高端设备制造厂商，主要致力于高端软X射线显微镜的研发及生产，其产品SXT-100一经推出，就受到了市场的极大关注，凭借其特殊的优势，获得 CoCID (Compact Cell-Imaging Device) 项目235万欧元资助，支持其从细胞结构成像角度助力抗病毒药物的研发。
关于Quantum Design 中国：Quantum量子科学仪器贸易（北京）有限公司(暨Quantum Design中国子公司)成立于2004年，是美国Quantum Design公司在全世界设立的诸多子公司之一，在全权负责美国公司本部产品在中国的销售及售后技术支持的同时，还积极致力于和世界范围内物理、化学、生物领域的科学仪器制造商进行密切合作，帮助中国市场引进更多全球范围内的优质设备和技术，助力中国科学家的项目研究和发展。
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